Современные представления о механизме коллагенстимулирующего действия PLA

Процесс стимуляции выработки коллагена после инъекции PLA изучали как на животных моделях, так и на людях, причем доклинические исследования на животных моделях нашли свое отражение и были подтверждены результатами последующих исследований на людях. Интересно, что биологические эффекты и переносимость PLA могут сильно разниться в зависимости от того, какой стереоизомер будет применен. В исследовании Quan Gao и соавт. [8] на лабораторных животных было показано, что после внутрикожной инъекцииPLLA индуцирует значительно меньшую воспалительную реакцию, чем PDLA и PDLLA. Экспрессия воспалительных цитокинов (IL-1β, IL-6 и TNF-α) вокруг места инъекции, индуцированная PDLA, была соответственно в 3,2, 2,5 и 2,0 раза выше, чем индуцированная PLLA, и в 2,3, 1,9 и 1,4 раза выше, чем индуцированная PDLLA. К тому же PLLA значительно стимулировала синтез коллагена, который был в 1,4 и 1,1 раза выше, чем при стимуляции PDLA и PDLLA соответственно. Эти результаты подтвердили превосходство PLLA в качестве дермального наполнителя.

Как доклинические, так и клинические исследования реакции тканей на PLLA на людях иллюстрируют ослабевающую с течением времени субклиническую воспалительную реакцию на инородное тело, что приводит к инкапсуляции микрочастиц с после- дующей деградацией PLLA и отложению коллагена I типа во внеклеточном матриксе (рис. 6).

Реакция организма на чужеродный материал (Foreign Body Reaction, FBR) включает три последовательных события: абсорбцию белка, рекрутирование клеток и фиброзную инкапсуляцию. Сразу после инъекции и в течение ближайших часов после имплантации препарата PLLA происходит абсорбция белка, за которой следует инфильтрация поврежденных тканей нейтрофилами, а затем макрофагами. Белки, которые абсорбируются на поверхности биоматериала, представлены альбумином, фрагментами комплемента, фибриногеном, фибронектином, иммуноглобулином G и витронектином. Все они являются хемоаттрактантами, привлекающими воспалительные клетки. Привлечение клеток воспаления опосредуется также гистамином, который выделяется в результате дегрануляции тучных клеток [10]. В результате в область введения PLLA проникают моноциты и хелперные Th2- клетки. Формирующиеся из моноцитов макрофаги также выделяют сигнальные молекулы, привлекая к имплантату дополнительные макрофаги [11].

Основными игроками следующего этапа клеточной реакции на введенныйPLLA становятся макрофаги, которые в большом количестве бывают обнаружены в клеточном инфильтрате в непосредственной близости от частиц PLLA. Если инородный материал не может быть фагоцитирован, эпителиоидные клетки и макрофаги сливаются друг с другом под влиянием IL-4 и/или IL-13 с образованием гигантских клеток инородных тел (ГКИТ) и формированием фиброзной капсулы. В результате этих процессов микрочастицы PLLA в течение 3 недель инкапсулируются, а через месяц после инъекции оказываются окружены тучными клетками, мононуклеарными макрофагами, клетками инородных тел и лимфоцитами [9].

Макрофаги – ключевые клетки, активирующие фибробласты для пролиферации и синтеза коллагена. Они продуцируют профибротические факторы, такие как трансформирующий фактор роста бета
(TGF-β1) и тромбоцитарный фактор роста (PDGF), которые поддерживают иммиграцию фибробластов
и стимулируют местные фибробласты к выработке коллагена внеклеточного матрикса, что в итоге приводит к инкапсуляции чужеродного материала [12]. В то время как TGFb является, по-видимому, ключевым медиатором синтеза коллагена и дифференцировки фибробластов в богатые α-актином миофибробласты гладких мышц (αSMA), PDGF способствует пролиферации миофибробластов [13].

Дифференцировка фибробластов в миофибробласты характерна для образования грануляционной ткани.
Чтобы подтвердить реакцию на PLLA, клеточный инфильтрат ткани, обработанной PLLA, был исследован с помощью иммунофлуоресценции, что позволило обнаружить макрофаги в непосредственной близости от PLLA, а фибробласты – на расстоянии от нее [11]. Иммунофлуоресцентное окрашивание ткани, обработанной PLLA, выявило существенное отложение коллагена III типа в примыкающей к PLLA области внутри гранулемы, в то время как миофибробласты откладывают фиброзный коллаген I типа на периферии капсулы. Интересно, что значительное усиление экспрессии мРНК коллагена I и III типов происходит сразу после первой инъекции PLLA [11].

Через 3 месяца уменьшение воспалительного ответа подтверждается уменьшением числа клеток. В это время также очевидно увеличение количества коллагеновых волокон. Через 6 месяцев количество макрофагов и фиброцитов продолжает уменьшаться, а производство коллагена – увеличиваться. На этой 6-месячной отметке воспалительная реакция прекращается, то есть состояние тканей возвращается к исходному уровню, однако значительное увеличение количества коллагена I типа происходит по периферии инкапсуляции PLLA между 8-м и 24-м месяцами после инъекции и позднее, поскольку коллагеногенез продолжается [9]. Это свидетельствует о том, что PLLA расщепляется в тканях человека гораздо медленнее, чем предполагалось ранее.

В каждом из упомянутых выше исследований авторы предполагали, что умеренное воспаление, вызванное PLLA, и паракринное воздействие ГКИТ были основными механизмами, приводящими к увеличению выработки нового коллагена в течение нескольких месяцев после инъекции. Гранулематозные реакции на наполнитель на основе поли-L-молочной кислоты уже описаны [14].

Гистологические исследования выявили реакцию на инородные тела и образование гигантских клеток инородных тел. Но ни биологический фон этих реакций, ни получаемый усиливающий эффект от введения PLLA до сих пор почти не изучены, и точные механизмы того, как PLLA может увеличивать выработку коллагена, пока не известны.

Клинический опыт показывает, что эффект увеличения объема мягких тканей лица как результат введения PLLA заметен уже через месяц после инъекции [15], что намного быстрее, чем скорость, о которой сообщали в статьях ранее. Таким образом, стоит предположить, что PLLA может непосредственно воздействовать на дермальные фибробласты.

В 2019 году Kim S.A. с соавт. [15] провели исследования, целью которых была оценка влияния PLLA на синтез коллагена и связанные с ним сигнальные пути в культивируемых дермальных фибробластах. Авторы культивировали клеточную линию Hs68 (дермальный фибробласт человека) и стимулировали клетки с помощью PLLA.Для этого к сухому порошку PLLA (Sculptra®; Sanofi Aventis, Франция) добавляли стерильную воду, получая в итоге 0,1%-ную концентрацию PLLA в культуральной среде. Резко усиливающаяся экспрессия мРНК коллагена I типа была обнаружена с помощью RT-PCR-реакции в реальном времени при 48-часо- вой инкубации. Это позволило авторам говорить о том, что PLLA увеличивает транскрипцию мРНК коллагена I типа в течение значительно более короткого периода времени, чем было принято считать ранее (рис. 7а).

Чтобы проверить, сопровождалось ли увеличение транскрипции мРНК коллагена увеличением синтеза белка коллагена, измерили концентрацию проколлагена в среде в соответствии с протоколом производителя (Takara Bio, Otsu, Japan). Выяснили, что количество проколлагена под действием PLLA значительно выросло, что полностью соответствовало данным об увеличении транскрипции мРНК коллагенаI типа (рис. 7б).

Морщины образуются из-за изменений в организации и структуре дермы. Фибробласты морщин человека (ФМ) имеют несколько другой функциональный профиль, чем фибробласты гладкой кожи людей среднего возраста(ФГК). Нормальные, функционально активные фибробласты могут реорганизовывать коллагеновые волокна, однако с возрастом их миграционные способности, как и способность к синтезу коллагена, снижаются. В процессе старения нарушается митохондриальная функция фибробластов, что отражается нарастанием лактата, снижается потенциал их пролиферации, уменьшается сократительная способность (рис. 8).

Courderot-Masuyer C. et al (2012) [17] исследовали способность PLLA компенсировать снижение метаболической активности и восстанавливать миграционную функцию ФМ, а также ингибировать синтез лактатав ФГК. Они использовали два разных образца кожи, взятой во время операции по подтяжке кожи у 3 женщин (один – из области морщин на лице, второй – из области гладкой кожи). Авторы установили, что введение в культуру PLLA повышает синтез коллагена I типа, восстанавливает способность фибробластов к миграции, способствует снижению продукции лактата в ФГК, а также стимулирует их пролиферацию и улучшает миграцию. Эти результаты свидетельствуют о том, что PLLA действует как стимулятор выработки в коже коллагена и подходит для коррекции морщин.

Линейка коллагенстимулирующих препаратов на основе PLLA Gana Fill состоит из двух сертифицированных продуктов южнокорейского производства – Gana X и Gana V (рис. 10а). В их состав входят PLLA, карбоксиметилцеллюлоза и маннитол. Диаметр частиц Gana Fill 30–50 мкм (рис. 10б), что сопоставимо с размером фибробластов, который колеблется от 20 до 25 мкм у недифференцированных их форм и до 40–45 мкм у зрелых[18].